在上一期的qPCR反應(yīng)漫談中，從一開始沃森和克里克兩位基因?qū)W奠基人的兩個(gè)論點(diǎn)簡單延伸至染料法和探針法兩類常見的qPCR反應(yīng)。
這一期做一個(gè)從PCR反應(yīng)過程出發(fā)到一些實(shí)驗(yàn)問題優(yōu)化的分享。
01
(先拋磚）PCR反應(yīng)原理：
PCR通過變性、退火和延伸三個(gè)步驟的循環(huán)往復(fù)，模擬DNA在體外擴(kuò)增的過程：
1. ?變性?：通過加熱使雙鏈DNA解開成為兩條單鏈，溫度通常在95℃左右。
2. ?退火?：降低溫度至55-70℃，使引物與單鏈DNA模板上的互補(bǔ)序列結(jié)合。
3. ?延伸?：在適宜的溫度下（72℃左右），DNA聚合酶以引物為起點(diǎn)，合成新的DNA鏈。
02
然后圍繞著這三點(diǎn)需要確認(rèn)：
1. 變性的時(shí)間足夠嗎？在變性階段，DNA是不是已經(jīng)解旋為單鏈？
2. 退火溫度（Tm值）設(shè)置的合理嗎？探針的Tm值是不是比引物的Tm值高，已先于引物結(jié)合在模板上？上下游引物的Tm值是不是接近，有近似的擴(kuò)增效率？
3. 延伸溫度是否足夠，延伸時(shí)間是否足夠，是否了解所用聚合酶的特性？
首先，DNA成為單鏈?zhǔn)且锟梢皂樌Y(jié)合的前提，如果沒有經(jīng)過充分的解旋，擴(kuò)增效率肯定會(huì)大受影響（等溫?cái)U(kuò)增不在此列）。比如擴(kuò)增cDNA變性大概10sec就夠，擴(kuò)增質(zhì)粒則往往要30sec及以上。
其次，熒光探針需要先于引物結(jié)合到模板上，不論是水解探針還是蝎形探針。否則就會(huì)出現(xiàn)變性好的單鏈DNA在引物和酶的作用下都已經(jīng)補(bǔ)齊了另一條鏈了，探針還在一邊傻傻的說：“我沒上車啊~"
最后，常規(guī)的qPCR擴(kuò)增片段一般在200bp左右，延伸時(shí)間設(shè)定30-45sec也基本夠用。至于說延伸溫度，多會(huì)把退火和延伸合并為一步，溫度采用60℃。但是有些反應(yīng)，因?yàn)檎w的反應(yīng)優(yōu)化不太理想或者是反應(yīng)自身的一些固有限制，兩步法擴(kuò)增的效果不夠好，此時(shí)可以使用三步法擴(kuò)增，提高產(chǎn)物積累。采用三步法擴(kuò)增時(shí)有個(gè)值得推敲的點(diǎn)，信號(hào)收集該是在退火階段還是延伸階段？染料法、水解探針、蝎形探針的答案并不一樣，可自行推導(dǎo)一番然后理論聯(lián)系實(shí)際驗(yàn)證一下。
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