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PCR技術(shù)原理剖析- 實時熒光定量
閱讀：2267 發(fā)布時間：2013-8-2實時熒光定量 PCR技術(shù)原理
聚合酶鏈?zhǔn)椒错?nbsp;（ PCR） 可對特定核苷酸片斷進(jìn)行指數(shù)級的擴(kuò)增。在擴(kuò)增反應(yīng)完畢之后，我們能夠經(jīng)過凝膠電泳的辦法對擴(kuò)增產(chǎn)品進(jìn)行定性的分析，也能夠經(jīng)過放射性核素?fù)饺?/span>標(biāo)記后的光密度掃描來進(jìn)行定量的剖析。無論定性或是定量剖析，剖析的都是PCR終產(chǎn)品。所謂的實時熒光定量PCR即是通過對PCR擴(kuò)增反響中每一個循環(huán)產(chǎn)品熒光信號的實時檢測然后完成對開始模板定量及定性的剖析。在實時熒光定量PCR反響中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，跟著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)品不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。
熒光擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線能夠分紅三個期間
熒光背景信號階段, 熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光布景信號所掩蓋，我們無法判別產(chǎn)品量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)品已不再呈指數(shù)級的增長。 PCR 的終產(chǎn)品量與開始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以依據(jù)后的 PCR 產(chǎn)品量不能計算出開始 DNA 拷貝數(shù)。只要在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR 產(chǎn)品量的對數(shù)值與開始模板量之間存在線性關(guān)系，咱們能夠挑選在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和對比的便利，在實時熒光定量 PCR 技能中導(dǎo)入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT 值。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值，它能夠設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增期間任意方位上。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號抵達(dá)設(shè)定的域值時所閱歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值（threshold value）。