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免疫熒光法測定抗原的基本原則以及注意事項(xiàng)
閱讀：2074 發(fā)布時(shí)間：2013-8-29采用直接免疫熒光法測定抗原
基本原則
熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體與相應(yīng)的抗原，直接反應(yīng)。簡單，特異性高的優(yōu)點(diǎn)，非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)是靈敏度低；每個(gè)檢查抗原要求熒光抗體的制備。免疫病理學(xué)檢查方法常用于細(xì)菌，病毒和其他快速檢查和活檢，皮膚活檢。
儀器和試劑
L磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol／，pH7.4
抗體溶液的熒光標(biāo)記物：0.01mol／L PBS，pH7.4稀釋
l緩沖甘油：純無熒光甘油9 + pH9.2 0.2m碳酸鹽緩沖液1例分析。
l漆三桶（用0.01mol／PBS，pH7.4 1500ml）
我覆蓋的搪瓷盒（一層紗布?jí)|鋪浸泡）
熒光顯微鏡
我滑架
L濾波器
我37℃溫箱等。
實(shí)驗(yàn)程序
1滴0.01 mol/L PBS，pH7.4的檢測樣張，10min后試樣的丟棄，保持一定的濕度。
熒光標(biāo)記的2抗體溶液加入適當(dāng)稀釋，并*覆蓋件，覆蓋釉質(zhì)瓷箱下，保溫時(shí)間（參考：30min）。
3拆下滑動(dòng)，滑架，先用0.01mol/L，pH7.4 PBS沖洗，然后根據(jù)0.01mol/L秩序，pH7.4 PBS三缸浸泡3-5分鐘，每個(gè)氣缸，不時(shí)振蕩。
4刪除幻燈片，用濾紙吸去多余的水分，但不使標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，布滿了。
5立即用熒光顯微鏡。具體的觀察到的熒光強(qiáng)度，一般可用“+”的意思：
（-）無熒光；熒光（±）可疑很弱；（+）熒光較弱，但清晰可見；（2+）熒光（+ + +——+ + + +）熒光閃閃發(fā)光。檢測到特異性熒光染色強(qiáng)度試件是“+”，以及各種控制顯示器（+）或（-），可以被看作是積極的。
注意事項(xiàng)
1對(duì)熒光標(biāo)記的抗體稀釋，以確?？贵w蛋白有一定的濃度，一般不應(yīng)超過1:20稀釋，低濃度的熒光抗體，導(dǎo)致太弱，觀察。
2染色溫度和時(shí)間需要根據(jù)樣品和抗原不同而異，染色時(shí)間可以從10分鐘到30個(gè)小時(shí)，一般民有足夠的。染色采用室溫溫度（25℃），高于37℃可以提高染色效果，但不耐熱抗原（如日本腦炎病毒）可以用來在0-2℃溫度低，延長染色時(shí)間。低溫染色過液是37℃30分鐘效果好的多。
3為了保證熒光染色的正確性，*次測試設(shè)置下列控制，排除干擾的一些非特異性熒光染色。
（1）樣品的熒光控制：1-2 0.01 mol/L PBS pH7.4的標(biāo)本。
（2）比控制（抑制）：與特定的抗體未標(biāo)記的樣本，再加上熒光標(biāo)記的特異性抗體。
（3）陽性對(duì)照：已知的陽性標(biāo)本用特異性熒光抗體。
如果樣品熒光控制和具體控制無熒光或熒光弱，積極控制和檢測的標(biāo)本顯示很強(qiáng)的熒光，特異性陽性染色。
4一般標(biāo)本比高壓汞燈下照射3min，熒光減弱，熒光在的觀察標(biāo)本染色，隨著時(shí)間的延長，其熒光強(qiáng)度降低。