BNL.1ME A.7R.1小鼠肝瘤株細(xì)胞系
BNL.1ME A.7R.1小鼠肝瘤株細(xì)胞系源自 BALB/c 小鼠的誘發(fā)性肝細(xì)胞癌，是保留肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化特征和肝內(nèi)高轉(zhuǎn)移潛能的經(jīng)典肝臟腫瘤模型，在肝細(xì)胞癌的肝內(nèi)侵襲機(jī)制、門靜脈轉(zhuǎn)移規(guī)律及肝靶向藥物篩選研究中具有重要價(jià)值，為解析這種原發(fā)于肝臟的惡性腫瘤的du特生物學(xué)行為提供了理想工具。
該細(xì)胞系呈現(xiàn)典型的肝細(xì)胞癌細(xì)胞形態(tài)與表型特征。顯微鏡下，細(xì)胞呈多邊形，以貼壁生長為主，排列呈不規(guī)則條索狀或巢狀，模擬正常肝細(xì)胞的排列方式。細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，核質(zhì)比高，染色質(zhì)呈粗顆粒狀，可見 1-2 個明顯核仁，核分裂象每 10 個高倍視野 6-8 個，胞質(zhì)豐富，呈嗜酸性，部分細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見脂肪空泡和嗜酸性顆粒（類似肝細(xì)胞的代謝特征）。電鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞膜上有微絨毛結(jié)構(gòu)，符合肝細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。免疫表型分析顯示，細(xì)胞高表達(dá)肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物甲胎蛋白（AFP）和白蛋白（ALB），流式細(xì)胞術(shù)檢測陽性率分別達(dá) 85% 和 80%，同時(shí)表達(dá)肝細(xì)胞癌相關(guān)抗原 Hep Par 1（陽性率 75%），而膽管細(xì)胞標(biāo)志物 CK19 表達(dá)陰性，證實(shí)其肝細(xì)胞來源特性。
體外培養(yǎng)體系中，BNL.1ME A.7R.1 細(xì)胞展現(xiàn)出穩(wěn)定的增殖能力與強(qiáng)肝內(nèi)侵襲潛能。最適培養(yǎng)條件為含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基，添加 1% 非必需氨基酸和 10μg/mL 胰島素，在 37℃、5% CO?環(huán)境下，傳代周期約 72 小時(shí)，對數(shù)生長期細(xì)胞活力達(dá) 90% 以上，倍增時(shí)間約 50 小時(shí)。其顯著特點(diǎn)是體外可形成類似肝板的細(xì)胞排列，相鄰細(xì)胞間形成膽小管樣結(jié)構(gòu)，這種特性與其高表達(dá)細(xì)胞間連接蛋白緊密連接蛋白 - 1（ZO-1）相關(guān)（表達(dá)量較其他肝癌細(xì)胞系高 25%）。Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，其穿透肝竇內(nèi)皮細(xì)胞單層的能力是其他肝癌細(xì)胞系的 1.8 倍，這種肝內(nèi)定向侵襲性依賴于高表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶 - 9（MMP-9），酶活性較其他肝癌細(xì)胞高 3 倍，可高效降解肝竇基底膜的 Ⅳ 型膠原。軟瓊脂克隆形成率達(dá) 40%，克隆形態(tài)呈圓形或不規(guī)則形，邊緣清晰，連續(xù)傳代 50 次后，AFP 表達(dá)及肝內(nèi)侵襲能力無明顯衰減，凍存復(fù)蘇存活率超 85%。
在動物模型中，BNL.1ME A.7R.1 細(xì)胞的成瘤與轉(zhuǎn)移模式j(luò)i具特點(diǎn)。將 1×10?個細(xì)胞肝內(nèi)接種 BALB/c 小鼠，7 天形成局部腫瘤，14 天出現(xiàn)門靜脈癌栓（發(fā)生率 70%），21 天肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶數(shù)量達(dá) 15-20 個 / 肝臟，模擬人類肝細(xì)胞癌的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移偏好。病理切片顯示原發(fā)瘤呈結(jié)節(jié)狀生長，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶沿門靜脈分支分布，破壞肝小葉結(jié)構(gòu)，免疫組化可見 AFP 陽性細(xì)胞在肝內(nèi)彌漫浸潤。熒光標(biāo)記追蹤證實(shí)，腫瘤細(xì)胞通過門靜脈系統(tǒng)播散并定植于肝內(nèi)，高表達(dá)門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子 CD146，黏附率達(dá) 60%，CD146 抗體處理可使肝內(nèi)轉(zhuǎn)移率下降 65%。
發(fā)病機(jī)制研究揭示其te有的分子異常?；驕y序顯示，細(xì)胞存在 β-catenin 基因第 3 外顯子突變（S45F）和 p53 基因缺失，導(dǎo)致 Wnt/β-catenin 通路持續(xù)激活，Western blot 檢測顯示核內(nèi) β-catenin 表達(dá)量較正常肝細(xì)胞高 8 倍，下游靶基因 Cyclin D1 和 c-Myc 表達(dá)上調(diào) 5 倍和 6 倍，使用 Wnt 通路抑制劑處理后，細(xì)胞增殖率下降 60%，凋亡率上升 40%，證實(shí)該通路在其惡性增殖中的核心作用。此外，細(xì)胞中 PI3K/Akt 信號通路異常激活，磷酸化 Akt（p-Akt）水平較正常肝細(xì)胞高 5 倍，可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的分泌，VEGF 是誘導(dǎo)肝內(nèi)血管生成的關(guān)鍵因子，該細(xì)胞分泌的 VEGF 量是正常肝細(xì)胞的 4 倍，抗 VEGF 抗體處理可使肝內(nèi)微血管密度減少 55%。
轉(zhuǎn)移機(jī)制方面，BNL.1ME A.7R.1 細(xì)胞的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移涉及多重調(diào)控。除 CD146 介導(dǎo)的黏附外，細(xì)胞高表達(dá)趨化因子受體 CXCR4，可響應(yīng)肝組織高濃度的 CXCL12，遷移能力是 CXCR4 陰性細(xì)胞的 2.3 倍，CXCR4 拮抗劑處理可使肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶數(shù)量減少 50%。基因芯片分析顯示，轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞中與肝竇定植相關(guān)的基因 ITGB1（整合素 β1）表達(dá)上調(diào)，該分子可與肝竇基質(zhì)中的層粘連蛋白結(jié)合，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在肝內(nèi)的存活與增殖，ITGB1 抗體處理可使轉(zhuǎn)移灶體積縮小 60%。
在藥物篩選應(yīng)用中，該細(xì)胞系是評估肝細(xì)胞癌靶向藥物的有效模型?；谄?β-catenin 突變特性，對 Wnt 通路抑制劑敏感，半數(shù)抑制濃度（IC50）約 0.6μM，藥物處理后細(xì)胞 G1 期比例增加 45%，凋亡率上升 35%。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，Wnt 通路抑制劑口服可使 BALB/c 小鼠肝內(nèi)腫瘤體積縮小 70%，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移率從 70% 降至 25%，療效顯著。其肝靶向特性使其成為肝靶向藥物的理想模型，某新型肝靶向納米載藥系統(tǒng)搭載藥物后，對該細(xì)胞的殺傷率達(dá) 80%，較游離藥物提高 40%，且在肝內(nèi)腫瘤組織的富集量增加 5 倍。
在腫瘤微環(huán)境研究中，BNL.1ME A.7R.1 細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞的相互作用為解析轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了線索。共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，肝星狀細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長因子 -β（TGF-β）可激活腫瘤細(xì)胞的 Smad 通路，使 MMP-2 表達(dá)上調(diào) 3 倍，侵襲能力增強(qiáng) 50%，TGF-β 中和抗體可阻斷這種促進(jìn)作用。在缺氧微環(huán)境（1% O?）中，細(xì)胞 HIF-1α 表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 GLUT3 表達(dá)，使細(xì)胞在低氧環(huán)境下的存活率達(dá) 90%，HIF-1α 抑制劑處理可降低其缺氧適應(yīng)能力。
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