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PCR反應特異性決定因素與提高方法
閱讀：933 發(fā)布時間：2023-12-18PCR 反應特異性主要決定因素：
1引物。引物的結構和長度是PCR特異性的關鍵。此外，引物濃度過高會增大形成引物二聚體的概率，從而降低PCR特異性。
2、復性溫度。在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。
3、延伸時間。延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。
4、Mg2+濃度。Mg2+濃度對PCR擴增的特異性有顯著影響。Mg2+濃度過高時，容易出現(xiàn)非特異性擴增，使反應特異性降低。
5、DNA聚合酶的種類和數(shù)量。不同種類的酶對PCR特異性的影響程度不同；酶的量過多更容易引起非特異性擴增。
PCR 反應特異性提高方法：
1. 引物的設計
引物最好在模板 cDNA 的保守區(qū)設計，長度 15-30bp，GC 含量小于 60%，3’端不超過連續(xù)三個 G 或 C，堿基分
布錯落有致，避免引物自身形成二聚體，設計完成之后，需進行 BLAST 檢測，如果與其他基因不具有互補性，則可以進行下一步實驗。
2. 降落 PCR
降落 PCR 是一種簡單的降低非特異性產(chǎn)物的 PCR，最大的優(yōu)點就是可以降低實驗耗時，同時又可以優(yōu)化實驗的步驟。引物的設計決定退火溫度，退火溫度過高會使 PCR 效率過低，過低則會使非特異擴增過多。這雖然可以通過反復嘗試來優(yōu)化，但費時費力。降落 PCR 提供了一個較為簡易的優(yōu)化方法。首先在較高的溫度下擴增，此時雖然擴增效率低，但非特異擴增基本沒有。隨著退火溫度的降低，非特異擴增會逐步增多。但由于此時特異的擴增產(chǎn)物已經(jīng)達到一定的數(shù)量優(yōu)勢，因此會對非特異擴增產(chǎn)生強烈的競爭抑制，從而大幅提高 PCR 的特異性和效率。
3. 熱啟動擴增
采用熱啟動方法進行擴增，是除了設計最佳引物之外，提高 PCR 反應特異性好的方式。在一般的 PCR 反應中，試劑的配置需在冰上進行，且要將 PCR 儀預熱，這種方法就類似于熱啟動，能夠一定程度的抑制錯配。但是酶在低溫下也存在活性，只要體系中有 DNA 鏈存在，就會擴增產(chǎn)生非特異性條帶。采用熱啟動的方法就是在達到變性溫度之前wan全抑制酶的活性，而zui有效的方法就是使用熱啟動 Taq 酶(或熱啟動高保真聚合酶)去擴增，它的原理就是采用化學修飾的方法封閉酶的活性中心，當溫度上升到 95℃時恢復活性，指導擴增。
4. 巢式 PCR
采用巢式 PCR 進行擴增，在多輪擴增結果中提高擴增特異性和靈敏度。與普通 PCR 不同的是，它采用兩對引物進行擴增，首先用第一對引物普通 PCR，然后將第一輪擴增的產(chǎn)物稀釋 100 倍后用第二對引物(巢式引物)二次擴增。因此采用巢式 PCR 可以大大增加困難模板擴增的特異性和有限靶序列的靈敏度。