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BCA蛋白濃度測定試劑盒實(shí)驗(yàn)測定方法
閱讀：1234 發(fā)布時(shí)間：2024-12-3 BCA 蛋白定量法是一種快速靈敏、穩(wěn)定可靠的蛋白定量測定方法，其測定范圍是10－2000ug/ml，是比Lowry 法更優(yōu)的專用于檢測總蛋白質(zhì)含量的產(chǎn)品。BCA法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響。其在562nm 處有最大的吸收值，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可計(jì)算待測蛋白的濃度。
原理: BCA(bicinchonininc acid)與二價(jià)銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑，混合一起顯示為蘋果綠色，即BCA 工作試劑。在堿性條件下，BCA 與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+，一個(gè)Cu+螯合二個(gè)BCA 分子，工作試劑由原來的蘋果綠形成紫色復(fù)合物，最大光吸收強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度成正比。
測定方法：（96孔板）
1、配制BCA 工作液: 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50 體積試劑A，1 體積試劑B 配制適量BCA 工作液，充分混勻。
2、將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按0, 1, 2, 4, 6，8, 10 微升加到96 孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足到10 微升；取10 微升待測樣品加入96 孔板。每個(gè)測定要做2-3 個(gè)平行.
3、向帶測樣品孔和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入200 微升BCA工作液（即樣品與工作液的體積比為1：20）混勻。
4、37℃溫浴30min。冷取至室溫。
5、酶標(biāo)儀562nm 波長下測定吸光度。
6、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出樣品濃度。
注意事項(xiàng)：
1、反應(yīng)顏色的深淺除了與樣品的蛋白質(zhì)濃度相關(guān)外，還與反應(yīng)的溫度有關(guān)。如果樣品
的濃度較高（>50μg/ml），反應(yīng)溫度一般采用37 度。如果樣品蛋白質(zhì)的濃度較低
（<50μg），反應(yīng)的溫度為60℃，該溫度下，色氨酸、酪氨酸和肽鍵得到充分氧化，大
大提高檢測靈敏度。
2、該方法檢測的蛋白質(zhì)濃度范圍20μg-500μg/ml；當(dāng)?shù)鞍诐舛龋?0ug/ml 時(shí)，推薦60℃
溫浴，并將蛋白液：工作液的比例調(diào)至1：8 進(jìn)行測定（增強(qiáng)法）可以檢測到5ug/ml。
試劑A 和B 在室溫的穩(wěn)定期至少1 年以上。標(biāo)準(zhǔn)蛋白液保存在－20℃,短期則4℃保存.