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相比傳統(tǒng)批量和補(bǔ)料分批培養(yǎng)，灌流培養(yǎng)技術(shù)是增強(qiáng)細(xì)胞培養(yǎng)工藝效率，提高重組蛋白，特別是單克隆抗體產(chǎn)品，單位體積產(chǎn)量和質(zhì)量的重要手段，經(jīng)過相當(dāng)一段時間的發(fā)展，已被生物制藥企業(yè)廣為采用。而細(xì)胞灌流培養(yǎng)是上游生物工藝“"可實現(xiàn)的連續(xù)技術(shù)，所以隨著連續(xù)工藝的推廣，灌流的使用也是未來的必然路徑。

作為細(xì)胞灌流培養(yǎng)工藝的核心，細(xì)胞截留設(shè)備的選擇是成功進(jìn)行灌流操作的關(guān)鍵，市面上有基于細(xì)胞沉降、超聲、連續(xù)流離心以及旋轉(zhuǎn)濾器等技術(shù)，雖各具優(yōu)勢，但也在可放大性、可靠性以及操作風(fēng)險方面存在一定缺陷，而基于中空纖維切向流過濾（HF TFF）的細(xì)胞灌流技術(shù)已然成為制藥工業(yè)的市場主流。

蠕動泵TFF的問題，膜污染和產(chǎn)物截留的原因

用于細(xì)胞灌流培養(yǎng)時，HF TFF有兩種液流形式：傳統(tǒng)的循環(huán)回路方式和今年來廣受歡迎的交替流方式，即Alternating Tangential Flow（ATF）。

傳統(tǒng)TFF一般使用蠕動泵作為液流驅(qū)動方式，液流單向循環(huán)，通常被認(rèn)為在灌流過程中，容易形成膜污染，導(dǎo)致產(chǎn)物被截留；而ATF采用隔膜泵，液流被往復(fù)“推-拉"，這種技術(shù)假定正/反向的液流形式，可在運(yùn)行過程中對膜進(jìn)行反沖，使膜“再生"，從而獲得更好的產(chǎn)物回收。

而Samantha W等研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞灌流培養(yǎng)中，導(dǎo)致傳統(tǒng)蠕動泵式TFF膜容易污染，產(chǎn)物截留的主要原因，是蠕動泵泵動過程中的“擠壓"方式形成的高剪切所導(dǎo)致的細(xì)胞裂解。

他們的實驗平行比較了蠕動泵TFF和ATF，使用孔徑0.2μm的中空纖維組件，進(jìn)行產(chǎn)mAb的CHO細(xì)胞灌流培養(yǎng)，設(shè)置液流流速，使中空纖維內(nèi)的剪切不超過2000S-1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蠕動泵TFF中的細(xì)胞生長速度低于ATF，活性下降較ATF快，產(chǎn)物截留也較ATF高。

在對反應(yīng)器中物料顆粒粒徑分布的分析中發(fā)現(xiàn)，采用蠕動泵TFF進(jìn)行灌流的反應(yīng)器中，100nm粒徑范圍的顆粒隨著灌流的進(jìn)行，不斷積聚，到第8天，已是ATF的4.5倍。顆粒的這個大小范圍，與0.2μm的孔徑大小接近，很容易造成堵塞，影響產(chǎn)物透過。

在對細(xì)胞活性的分析中也發(fā)現(xiàn)，在蠕動泵TFF灌流的反應(yīng)器中，出現(xiàn)了較高水平的細(xì)胞死亡，產(chǎn)生的細(xì)胞碎片以及釋放的核酸、蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞性成分很容易堵塞膜孔，并造成膜污染。

事實上，膜污染包括幾種不同的形式：膜表面形成凝膠層，膜孔橋接（搭橋）導(dǎo)致實際孔徑變小以及顆?！翱?進(jìn)膜孔導(dǎo)致膜孔堵塞等，往復(fù)推拉式的反沖過程，可以部分去除前兩種污染，但一旦顆粒碎片進(jìn)入膜孔基層，很難去除只能通過濾出端反沖或更換組件。

磁力離心泵TFF vs.ATF
之后，研究人員將TFF中使用的蠕動泵換成了低剪切的磁懸浮離心泵，與ATF進(jìn)行一對一的重新評估，培養(yǎng)至目標(biāo)VCD，開始cell Bleeding，以維持穩(wěn)定的VCD。結(jié)果顯示，磁力泵TFF和ATF可獲得相同的細(xì)胞生長曲線，在同一天達(dá)到目標(biāo)VCD，且兩種系統(tǒng)的細(xì)胞死亡率和100nm范圍的顆粒都沒有差別，且最終的產(chǎn)物收率也接近，磁力泵TFF為73%，ATF為71%。

磁力泵TFF和ATF比較，低剪切的磁力離心泵可消除TFF和ATF的性能差異，獲得相近結(jié)果，包括A）VCD、B）LDH檢測所得的特異性細(xì)胞死亡率、C）活性、D）產(chǎn)物濾過以及E）培養(yǎng)液中100nm粒徑范圍的顆?？倲?shù)。

結(jié)論

所以，文章的結(jié)論可概括為：

1. 傳統(tǒng)TFF系統(tǒng)用于細(xì)胞灌流培養(yǎng)時，產(chǎn)物濾過較差，是因為其使用的蠕動泵所產(chǎn)生的更高的細(xì)胞死亡率所導(dǎo)致的，而不在于ATF系統(tǒng)中交替式切向流所謂的更高的清洗作用。

2. 如果細(xì)胞死亡率相當(dāng)， TFF系統(tǒng)可獲得與ATF系統(tǒng)相似的產(chǎn)物濾過特性

3. 使用低剪切的磁懸浮離心泵，將是ATF的可行替代

我們能做的....

Spectrum是目前市場上主要的生物制藥用中空纖維產(chǎn)品供應(yīng)商之一，我們提供不同材質(zhì)、孔徑以規(guī)格的中空纖維組件，用于生物制藥、疫苗、診斷、納米材料等領(lǐng)域，也包括細(xì)胞灌流培養(yǎng)。

為了進(jìn)一步提高中空纖維細(xì)胞灌流技術(shù)的應(yīng)用，我們開發(fā)了整合磁懸浮離心泵的細(xì)胞灌流培養(yǎng)技術(shù)，并結(jié)合中空纖維細(xì)胞灌流流路的一次性使用優(yōu)勢，將灌流操作更加簡化。

中空纖維組件的重復(fù)使用，雖然在一定程度上可以節(jié)省成本，但是顯著增加了操作的復(fù)雜程度和風(fēng)險，首先，中空纖維高壓滅菌時要求按照嚴(yán)格的滅菌程序，否則容易導(dǎo)致組件泄漏，其次，增加了硬件設(shè)備的投入，如具有程序升溫功能的滅菌柜，而這種風(fēng)險和成本在進(jìn)行工藝放大時，也將相應(yīng)增加。

仕必純KML系列灌流系統(tǒng)，采用全整合設(shè)計，包括了進(jìn)行細(xì)胞灌流培養(yǎng)所需的所有部件，真正做到“即取即用"的獨(dú)立式操作，反應(yīng)器在哪，就可在哪進(jìn)行灌流培養(yǎng)，并實現(xiàn)自動化的平衡控制，沒有額外的泵、氣源等限制。

而針對細(xì)胞灌流培養(yǎng)過程中的產(chǎn)物截留問題，仕必純開發(fā)了TFDF組件，這種組件兼具切向流過濾和深層過濾的優(yōu)勢，結(jié)合2-5μm及1-3μm更加“寬松"的孔徑規(guī)格，可有效地避免膜污染，在特定條件下，可在整個灌流周期中，維持100%的產(chǎn)物透過。

另外，仕必純即將推出的KML-50系統(tǒng)，可使用更小的中空纖維組件，進(jìn)行低至250mL生物反應(yīng)器的灌流培養(yǎng)，真正做到scale-down，方便工藝條件篩選，在當(dāng)前的很多實驗中，小規(guī)模研發(fā)所用組件為了確定工藝的可行性，往往會選用oversize的組件，這就導(dǎo)致放大時，容易出現(xiàn)反應(yīng)器體積和中空纖維處理量不匹配的情況。進(jìn)行小規(guī)模的“極限挑戰(zhàn)"實驗，對膜的通量、載量、壓力等參數(shù)進(jìn)行綜合分析，可更“科學(xué)"與“合理"地進(jìn)行規(guī)模放大。