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ADC 內(nèi)化檢測(cè)
產(chǎn)品及檢測(cè)篇 Q&A
5. Q: Fab 探針是單抗還是多抗？
A: pHsence Eu 的 Fab 是多克隆抗體。因此 Fc 片段可能有多個(gè)表位被識(shí)別，若抗體存在點(diǎn)突 變、 Fc 端修飾，理論上來(lái)說(shuō)不用擔(dān)心 Fab 的結(jié)合。但為了確保，客戶需要進(jìn)行測(cè)試 來(lái)確認(rèn)這一點(diǎn)。
6. Q: pHsense Eu Fab anti-human IgG Fab 的分子量？
A: ~ 50KDa
7. Q：探針 PKa 是多少？
A: pH~6
8. Q: pHsense Eu 探針的效期？
A: 12 months (pHSense Eu Fab anti-Human lgG； pHSense Eu Fab anti-mouse IgG2)
9. Q：抗體/ADC 和探針?lè)跤龝r(shí)該注意什么？
A: Dose response assay 中，建議以濃度點(diǎn)與 pHsense Fab-Eu 孵育（室溫孵育 30min）， 后梯度稀釋。
10. Q：儀器參數(shù)如何設(shè)置？
A: 可參照《pHSense™ setup recommendations for Revvity microplate readers》進(jìn)行參數(shù)設(shè)置。
大多數(shù)情況下酶標(biāo)儀 TRF 模式按推薦參數(shù)設(shè)置可以滿足檢測(cè)需求。因選用的抗體、濃度及培養(yǎng) 體系不同， Delay 時(shí)間可以適當(dāng)延長(zhǎng)以減少非特異性信號(hào)。
11. Q: 如何分析待測(cè)樣本探針信號(hào)隨孵育時(shí)間增加而增強(qiáng)？
A: 實(shí)驗(yàn)孔探針信號(hào)增強(qiáng)主要來(lái)自兩個(gè)方面： 信號(hào)隨內(nèi)吞量增加而增強(qiáng)； 信號(hào)隨內(nèi)吞進(jìn)展 pH 降 低而增強(qiáng)。另外，若長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，培養(yǎng)基酸化會(huì)導(dǎo)致背景信號(hào)增加， 因此，對(duì)于不同濃度的待 測(cè)抗體均需設(shè)置對(duì)應(yīng)的 Fab only 對(duì)照，以便扣除背景得到特異性信號(hào)。
12. Q: 能判斷內(nèi)吞不同階段嗎？
A: 不能。信號(hào)來(lái)自整個(gè)孔當(dāng)中，所有細(xì)胞上抗體不同內(nèi)吞階段的 mix。后續(xù)將推出僅在晚期內(nèi) 體及溶酶體中特異發(fā)光的探針。
13. Q: 探針會(huì)透膜自發(fā)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)嗎？
A: 不會(huì)自發(fā)透膜?？赏ㄟ^(guò) Fab only 組扣除背景。
14. Q: 探針被內(nèi)吞進(jìn)入溶酶體中后會(huì)被排出造成信號(hào)降低嗎？
A: 探針的熒光強(qiáng)度與 pH 值有關(guān)。如果探針被排泄到比溶酶體酸性更小的腔室中， 將觀察到信 號(hào)的減少。
15. Q: 若細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞在每個(gè)孔的位置不一致，會(huì)影響結(jié)果嗎？
A: 酶標(biāo)儀為單孔多點(diǎn)數(shù)據(jù)， 能避免位置因素影響。另外，建議均勻種板。
16. Q: 多次讀數(shù)會(huì)有污染風(fēng)險(xiǎn)， 怎么解決？
A: 讀數(shù)前可使用靜電吸附膜貼膜（推薦貨號(hào)： 64TOPSAPRO-50，免撕透光， 兼容 TRF 檢測(cè)）。 17. Q: 貼壁細(xì)胞可以不用貼壁過(guò)夜，直接加探針抗體混合物孵育后檢測(cè)嗎？
A: 通常貼壁細(xì)胞需要過(guò)夜貼壁以維持正常的生理狀態(tài)。若通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，確定貼壁細(xì)胞懸浮狀 態(tài)不影響細(xì)胞抗原表達(dá)及內(nèi)吞狀態(tài)， 就可以直接添加探針抗體混合物。
18. Q: 有無(wú)做過(guò)血清容忍度測(cè)試？高血清檢測(cè)是否會(huì)影響數(shù)據(jù)？
A: 一般細(xì)胞培養(yǎng)的血清含量(小于等于 20%) 不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。且在相同培養(yǎng)基質(zhì)中獲得的數(shù)據(jù)是可以比較的。
