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閱讀：1047 發(fā)布時間：2024-7-8
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素主要有引物的選擇與設(shè)計，酶的質(zhì)量。模板的制備，在前二者都穩(wěn)定可行的情況下，PCR模板的制備尤為重要。模板處理方法的選擇及操作人員的基 本技能，決定分離模板核酸(DNA或RNA)的質(zhì)和量及PCR的成敗。而提高模板核酸質(zhì)量的 關(guān)鍵是除去雜質(zhì)(蛋白質(zhì)、酶、脂肪等)。除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子，提高模板核酸的產(chǎn)量。
傳統(tǒng)的核酸模板提取方法是采用去垢劑如SDS等來破壞細胞組份，溶解細胞膜，使蛋白質(zhì)變性，再用蛋白酶K來消化去除蛋白質(zhì)，尤其是與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，再用酚:抽提，然后用乙醇或異丙醇沉淀核酸，供PCR實驗用。但近幾年來也發(fā)展了些 簡便實用較為有效的標本消化處理方法。亦可滿足PCR實驗的要求。采用哪種方法消化 處理標本，視PCR實驗的目的(是科研還是檢測)及環(huán)境條件而定。
模板核酸的提取制備方法:
一、蛋白酶K消化裂解法：適用于所有標本的消化處理，尤以DNA樣品為佳。如組 織細胞(包括石蠟包埋組織)絨毛、毛發(fā)、精斑、血液(血清、血漿、全血)局部分泌 物、尿，糞便等。
1、試劑配制
1）蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)
10mmol/LEDTA
150mmol/LNaCL
0.5%SDS
100～200ug/ml蛋白酶K.
2）蛋白酶K最好用水配成20mg/ml，臨用時加入消化液中。
2、提取方法:
有些標本、在用蛋白酶K消化前，還需預(yù)處理一下，如糞便、分泌物、痰液、組 織塊、石蠟包埋組織等，其方法有離心去掉雜質(zhì)，脫蠟等。
臨床標本或經(jīng)預(yù)處理的標本加蛋白酶K裂解液50～100ul.混勻，55℃1～3小時， 或37℃過夜。加等體積的飽和酚抽提1～2次，再加等體積的:(49:1)抽提一 次，上清加入1/10體積的pH值5.23mmol/L醋酸鈉緩沖液，加入2.5倍體積的冰冷無水 乙醇(或加等體積的異丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000轉(zhuǎn)/min離心15min.小心吸 棄或倒出上清，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min離心洗滌1～2次，特別小心的 吸棄或倒掉上清，真空或37℃溫箱或室溫干燥，加TE緩沖液20ul.溶解后，取3～8ul 用于PCR擴增，或放-20℃保存。
蛋白酶K消化法除上述經(jīng)典處理法外，亦可在蛋白K消化處理標本，經(jīng)離心處理 后，吸取上清經(jīng)95～97℃或煮沸10min滅活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR擴增。 如雜質(zhì)較多，還可經(jīng)酚:抽提后，即可用于PCR反應(yīng)。此法蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)消除 *，Taq酶活性不受影響，具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。但操作繁復(fù)，技術(shù)要求高。
二、直接裂解法: 標本(組織細胞，分泌物)加PBS或生理鹽水離心洗滌后，加消化 裂解液20～50ul(0.5%NP-40和0.5%吐溫-20)，95～98℃，15～30min以裂解病原體，裂解細胞。然后12000r/min離心5～10min，取上清20～30ul用于PCR擴增。血清標本可 直加等體積的消化液，加熱處理離心后PCR擴增。亦有用5%的NP-40和1.5%2-ME做裂解 液，95℃30min消化處理，離心取上清，PCR擴增檢測HBV DNA.
三、堿變性法: 取血清20ul，加入1mol/L NaOH 20ul，37℃30min，離心，加 1mol/L HCl 20ul，離心后，取上清5ul，用于PCR擴增。*亦有用10ul血清加NaOH至 0.2mol/L，37℃1h，再加HCL中和離心后取上清10ul做PCR，其特異性和敏感性較前法 更好。
四、煮沸法: 經(jīng)離心洗滌過的組織細胞，分泌物及血液標本，加適量無菌蒸餾水或PBS，混勻 后，100℃煮沸10～15min，14000r/min 10min，取上清做PCR.
五、碘化鈉法: 取組織細胞及抗凝血液10～100ul，加等體積的6MNaI，反復(fù)輕混 20s，加等體積:(49:1)振勻后，離心取上清加0.6體積的異丙醇，混勻后 置室溫3min.14000r/min 10min，沉淀加10～100ul，TE溶解，取5～10ul做PCR，亦有 用100ul血清加裂解液300ul(6M NaI，0.5%十二烷基肌酸鈉，10ug糖原，26mmol/L pH8.0 Tris-HCL，13mmol/LEDTA)混勻后，60℃15min，加等體積異丙醇，離心沉定 后，加TE液用于PCR擴增，其產(chǎn)量和質(zhì)量較高。
六、異硫氰酸胍法
此法主要用于RNA的提取。標本為組織細胞及血清等。
1、異硫氰酸胍消化液
異硫氰酸胍4mol/L
檸檬酸鈉(PH7.0)25mmol/L
十二烷基肌酸鈉0.5%
β-巰基乙醇0.1mol/L
2、消化方法: 用50～100ul細胞懸液及血清，加等體積的異硫氰酸胍消化液振混勻 后，或65℃1小時，或室溫放置數(shù)分鐘，然后加1/10體積的3mmol/L pH5.2的醋酸鈉緩 沖液，再加等體積的酚:，用力振搖約10s，10000r/min，離心5min，取上清加等 體積異丙醇-20℃放置3h后，14000r/min離心15min，沉定用75%冰冷乙醇離心洗滌1～ 2次，真空干燥，沉淀用TE緩沖液溶解即可用于逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增，或放-20℃保存。
其它消化處理標本提模板核酸的方法有①異硫氰酸胍一二氧化硅法②異硫氰酸胍-玻璃粉法。③Chelex-100法。④全血直接擴增法⑤尿素消化裂解法。各有千秋，可根據(jù)情況選用。
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素主要有引物的選擇與設(shè)計，酶的質(zhì)量。模板的制備，在前二者都穩(wěn)定可行的情況下，PCR模板的制備尤為重要。模板處理方法的選擇及操作人員的基 本技能，決定分離模板核酸(DNA或RNA)的質(zhì)和量及PCR的成敗。而提高模板核酸質(zhì)量的 關(guān)鍵是除去雜質(zhì)(蛋白質(zhì)、酶、脂肪等)。除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子，提高模板核酸的產(chǎn)量。
傳統(tǒng)的核酸模板提取方法是采用去垢劑如SDS等來破壞細胞組份，溶解細胞膜，使蛋白質(zhì)變性，再用蛋白酶K來消化去除蛋白質(zhì)，尤其是與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，再用酚:抽提，然后用乙醇或異丙醇沉淀核酸，供PCR實驗用。但近幾年來也發(fā)展了些 簡便實用較為有效的標本消化處理方法。亦可滿足PCR實驗的要求。采用哪種方法消化 處理標本，視PCR實驗的目的(是科研還是檢測)及環(huán)境條件而定。
模板核酸的提取制備方法:
一、蛋白酶K消化裂解法：適用于所有標本的消化處理，尤以DNA樣品為佳。如組 織細胞(包括石蠟包埋組織)絨毛、毛發(fā)、精斑、血液(血清、血漿、全血)局部分泌 物、尿，糞便等。
1、試劑配制
1）蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)
10mmol/LEDTA
150mmol/LNaCL
0.5%SDS
100～200ug/ml蛋白酶K.
2）蛋白酶K最好用水配成20mg/ml，臨用時加入消化液中。
2、提取方法:
有些標本、在用蛋白酶K消化前，還需預(yù)處理一下，如糞便、分泌物、痰液、組 織塊、石蠟包埋組織等，其方法有離心去掉雜質(zhì)，脫蠟等。
臨床標本或經(jīng)預(yù)處理的標本加蛋白酶K裂解液50～100ul.混勻，55℃1～3小時， 或37℃過夜。加等體積的飽和酚抽提1～2次，再加等體積的:(49:1)抽提一 次，上清加入1/10體積的pH值5.23mmol/L醋酸鈉緩沖液，加入2.5倍體積的冰冷無水 乙醇(或加等體積的異丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000轉(zhuǎn)/min離心15min.小心吸 棄或倒出上清，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min離心洗滌1～2次，特別小心的 吸棄或倒掉上清，真空或37℃溫箱或室溫干燥，加TE緩沖液20ul.溶解后，取3～8ul 用于PCR擴增，或放-20℃保存。
蛋白酶K消化法除上述經(jīng)典處理法外，亦可在蛋白K消化處理標本，經(jīng)離心處理 后，吸取上清經(jīng)95～97℃或煮沸10min滅活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR擴增。 如雜質(zhì)較多，還可經(jīng)酚:抽提后，即可用于PCR反應(yīng)。此法蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)消除 *，Taq酶活性不受影響，具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。但操作繁復(fù)，技術(shù)要求高。
二、直接裂解法: 標本(組織細胞，分泌物)加PBS或生理鹽水離心洗滌后，加消化 裂解液20～50ul(0.5%NP-40和0.5%吐溫-20)，95～98℃，15～30min以裂解病原體，裂解細胞。然后12000r/min離心5～10min，取上清20～30ul用于PCR擴增。血清標本可 直加等體積的消化液，加熱處理離心后PCR擴增。亦有用5%的NP-40和1.5%2-ME做裂解 液，95℃30min消化處理，離心取上清，PCR擴增檢測HBV DNA.
三、堿變性法: 取血清20ul，加入1mol/L NaOH 20ul，37℃30min，離心，加 1mol/L HCl 20ul，離心后，取上清5ul，用于PCR擴增。*亦有用10ul血清加NaOH至 0.2mol/L，37℃1h，再加HCL中和離心后取上清10ul做PCR，其特異性和敏感性較前法 更好。
四、煮沸法: 經(jīng)離心洗滌過的組織細胞，分泌物及血液標本，加適量無菌蒸餾水或PBS，混勻 后，100℃煮沸10～15min，14000r/min 10min，取上清做PCR.
五、碘化鈉法: 取組織細胞及抗凝血液10～100ul，加等體積的6MNaI，反復(fù)輕混 20s，加等體積:(49:1)振勻后，離心取上清加0.6體積的異丙醇，混勻后 置室溫3min.14000r/min 10min，沉淀加10～100ul，TE溶解，取5～10ul做PCR，亦有 用100ul血清加裂解液300ul(6M NaI，0.5%十二烷基肌酸鈉，10ug糖原，26mmol/L pH8.0 Tris-HCL，13mmol/LEDTA)混勻后，60℃15min，加等體積異丙醇，離心沉定 后，加TE液用于PCR擴增，其產(chǎn)量和質(zhì)量較高。
六、異硫氰酸胍法
此法主要用于RNA的提取。標本為組織細胞及血清等。
1、異硫氰酸胍消化液
異硫氰酸胍4mol/L
檸檬酸鈉(PH7.0)25mmol/L
十二烷基肌酸鈉0.5%
β-巰基乙醇0.1mol/L
2、消化方法: 用50～100ul細胞懸液及血清，加等體積的異硫氰酸胍消化液振混勻 后，或65℃1小時，或室溫放置數(shù)分鐘，然后加1/10體積的3mmol/L pH5.2的醋酸鈉緩 沖液，再加等體積的酚:，用力振搖約10s，10000r/min，離心5min，取上清加等 體積異丙醇-20℃放置3h后，14000r/min離心15min，沉定用75%冰冷乙醇離心洗滌1～ 2次，真空干燥，沉淀用TE緩沖液溶解即可用于逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增，或放-20℃保存。
其它消化處理標本提模板核酸的方法有①異硫氰酸胍一二氧化硅法②異硫氰酸胍-玻璃粉法。③Chelex-100法。④全血直接擴增法⑤尿素消化裂解法。各有千秋，可根據(jù)情況選用。