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單層細胞傳代培養(yǎng)時常出現(xiàn)的問題
1. 細胞難脫離
• 培養(yǎng)基內(nèi)含有某些抑制成分（例如血清）使細胞解離液失活。
解決對策：在加入細胞解離液（dissociating solution）之前，先用DPBS潤洗細胞兩次或者是直接用細胞解離液潤洗細胞。
• 選用的細胞解離液太弱。
解決對策：提高酶濃度、EDTA濃度，或者使用作用更強的細胞解離液（如dispase, collagenase），或者是把細胞置于37°C孵育以提高解離液的活性。
• 細胞達到100%匯合時間太久，細胞間連接變得非常牢固，阻礙了解離液滲透到細胞與培養(yǎng)基質(zhì)接觸的界面。
解決對策：當(dāng)細胞達到大約70%-90%匯合時，即進行傳代。
2. 細胞脫離下來后聚集成團（Clumps）
• 分離過程太劇烈，導(dǎo)致細胞裂解釋放基因組DNA。原因有二：一，移液槍吹打太劇烈；第二，選用的細胞解離液太強或有毒性，導(dǎo)致pH或滲透壓異常。
解決對策：往細胞懸液內(nèi)加入一滴無菌DNAse (1 mg/ml in water)使DNA鏈斷裂。在隨后的操作中，注意溫和吹打細胞懸液，縮短孵育時間，換用弱一點的細胞解離液或者在低一點的溫度下孵育。
• 如果收集的單細胞懸液沒有立即加入培養(yǎng)基稀釋并接種到新的培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，而是在室溫放置一段時間。這種情況下，細胞也有可能會聚集成團。
解決對策：將細胞懸液放置在冰上。
• 細胞懸液離心去除多余解離液時，離心太劇烈或時間過久。
解決對策：確保溫和離心，推薦使用125g離心10 min。
3. 細胞重新貼壁困難
• 細胞解離過程持續(xù)時間過長，使得存在于細胞膜上的細胞附著所必需的蛋白剝離。
• 培養(yǎng)基內(nèi)缺少足夠的血清或黏附因子（常見于無血清培養(yǎng)基）。
解決對策：往培養(yǎng)基內(nèi)添加黏附因子或者選用蛋白（collagen, poly-L-lysine, fibronectin, gelatin, etc.）包被過的培養(yǎng)容器。
• 未失活細胞解離液或者離心去除細胞解離液。
解決對策：在培養(yǎng)基內(nèi)添加額外的血清或特異性酶抑制劑（例如，大豆胰蛋白酶抑制劑）中和細胞解離液。亦或使用125g離心5min去除細胞解離液，然后使用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞。
4. 細胞活力低
• 細胞分離過程太劇烈
解決對策：自行摸索解離時間。
• 配制細胞分離液所用的平衡鹽溶液（Balanced Salt Solution）pH或滲透壓異常。
解決對策：測量pH或滲透壓或直接換一瓶新的平衡鹽溶液。
• 在重新接種之前，單細胞懸液以非常高的細胞密度在室溫放置時間過長。
解決對策：將細胞懸液置于冰上。
• 培養(yǎng)基選擇不恰當(dāng)。
解決對策：推薦使用與原代細胞相配套的專屬培養(yǎng)基。