一、流式圖
流式細胞儀分析細胞都是高速的,目前分析速度基本都能達到每秒上萬個細胞,每個分析的細胞都能得到幾方面的信息,最基本的有FSC、SSC信號,如果再標記熒光素偶聯(lián)抗體,就會再增加多個熒光信號。為了全面直觀反映大量信息,就得采用流式圖來顯示。
流式圖有很多種,常用的是流式直方圖和散點圖,當然還有等高線圖等等。
流式直方圖只能顯示一個通道的信息,散點圖能顯示兩個通道的信息,相關(guān)分析軟件中甚至有能顯示三通道信息的3D圖。
流式直方圖
流式直方圖形成的原理與統(tǒng)計學中直方圖相似。其x軸表示一個通道的值,y軸表示細胞數(shù)量或者信號強度等等。
例:上圖中x軸表示FSC信號值,y軸表示位于各區(qū)間的細胞數(shù)
從上圖可以看出,根據(jù)FSC信號值的大?。醇毎w積),可以將上述細胞分為兩群:一群細胞的大小平均在35左右,占62%;第二群細胞的大小平均在95左右,占38%。
得出結(jié)論:這100個細胞由大小明顯不同的兩群細胞組成,并且小細胞占多數(shù)。
流式直方圖雖不是如此簡單,但基本原理是相同的。流式直方圖在統(tǒng)計直方圖的基礎上,使統(tǒng)計區(qū)間不斷的縮小,小到甚至可以認為一個值就是一個統(tǒng)計區(qū)間,而細胞數(shù)量不斷增加,致使相鄰區(qū)間內(nèi)的細胞數(shù)量差不多,這時直方圖就好像是由光滑的曲線所圍成的。
檢測值與實際值差異
性質(zhì)相同的一個細胞群在流式直方圖中是以正態(tài)分布曲線的形式出現(xiàn)的,其原因是流式檢測值與實際值之間存在著一定的誤差。
在大樣本條件下,檢測值與實際值相符或者偏離實際值越小的概率越大,而檢測值偏離實際值越大的概率越小,反映在流式直方圖上就表現(xiàn)為正態(tài)分布的圖形。
流式散點圖
流式散點圖能夠同時表示兩個通道的信息。x軸、y軸分別表示兩個不同通道的值,圖中每個點代表一個細胞,該點所對應的橫縱坐標即為該細胞兩個通道的信號值。
FSC-SSC散點圖
常見的即為FSC-SSC散射光通道散點圖,x軸:FSC代表細胞的大小,y軸:SSC代表細胞的顆粒度/形狀。該圖可以初步根據(jù)細胞的大小、顆粒度對細胞進行分群、分類,所以該圖又可以稱為細胞的“物理圖"。
例:上圖代表的是正常人外周血白細胞FSC-SSC散點圖。可以看出,細胞大致分為三群:紅色的是淋巴細胞(T、B、NK細胞等)、綠色的是單核細胞群、黃色的是中性粒細胞群。
門(gate)
門是流式分析中一個非常重要的概念,流式分析時有時不希望所有的樣品細胞都顯示于流式圖中,而希望只顯示感興趣的細胞,排除其他非相關(guān)細胞的干擾,使顯示的信息更加直觀、更具有針對性。
熒光信號散點圖
熒光通道表示的是細胞的化學特征。熒光通道接收到信號的強弱,可以反映細胞上結(jié)合的熒光素的量,進一步反映細胞上表達某分子的量,最后間接反映細胞表達某分子這一化學特征。
注意:不同于FSC-SSC散點圖,F(xiàn)SC和SSC最多相差幾倍,而熒光信號強弱之間相差很大,陰陽性細胞之間可以相差幾百、幾千倍,呈指數(shù)形式。所以,F(xiàn)SC-SSC散點圖單位數(shù)值以“一般數(shù)序形式"表示,而熒光通道常以“對數(shù)形式"表示。
在流式散點圖中,呈典型放射狀分布的圓形所代表的是性質(zhì)相同的細胞群,呈長條形或者橢圓形的則表示該細胞群其中一個參數(shù)所代表的的化學性質(zhì)不相同,很可能存在著表達上的強弱差異。
但是,這里需要指出,通過流式散點圖判斷細胞群某一性質(zhì)是否存在差異不如通過流式直方圖判斷準確,因為,流式散點圖中的細胞群的形狀受影響的因素有很多,不僅表達強弱差異會影響,通道之間的熒光補償調(diào)節(jié)也會直接影響細胞群的形狀,從而使原來典型放射狀分布的圓形變成長條形,流式分析時需要綜合考慮這些因素。
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