穩(wěn)定同位素是指質(zhì)子數(shù)相同而中子數(shù)不同、且原子核結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不發(fā)生自發(fā)放射性衰變的同一元素的不同原子形式，例如氘（2H）、碳-13（13C）、氮-15（1?N）和氧-18（1?O）等。目前自然界中已發(fā)現(xiàn)274種穩(wěn)定同位素，它們因質(zhì)量差異在物理、化學(xué)及生物過程中產(chǎn)生同位素分餾效應(yīng)，從而成為表征物質(zhì)遷移與轉(zhuǎn)化路徑的天然示蹤劑，被廣泛應(yīng)用于多個(gè)科研與工業(yè)領(lǐng)域。

在藥物研發(fā)中，穩(wěn)定同位素標(biāo)記化合物發(fā)揮著關(guān)鍵作用。制藥企業(yè)及生物技術(shù)公司將其應(yīng)用于藥代動(dòng)力學(xué)（DMPK）研究、制劑開發(fā)與安全性評(píng)價(jià)，通過同位素標(biāo)記實(shí)現(xiàn)藥物及其代謝產(chǎn)物在生物體內(nèi)的精準(zhǔn)定性、定量追蹤。合同研究組織（CRO）則借助此類標(biāo)記物實(shí)現(xiàn)跨實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)可比性與一致性，提升研究結(jié)果的可靠性與重現(xiàn)性。此外，高等院校與科研機(jī)構(gòu)也利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)揭示生物代謝通路和環(huán)境系統(tǒng)中物質(zhì)的動(dòng)態(tài)行為。

在分析檢測(cè)中，穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)對(duì)于提高定量分析的準(zhǔn)確度和精密度至關(guān)重要，電噴霧質(zhì)譜法尤其如此。本文介紹了選擇與使用同位素內(nèi)標(biāo)時(shí)的關(guān)鍵因素，比如同位素純度、同位素標(biāo)記位點(diǎn)、內(nèi)標(biāo)與分析物之間的分子量差異、以及內(nèi)標(biāo)和分析物之間的摩爾對(duì)等性等。

Section.01

如何選擇合適的穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)

有很多不同品牌的供應(yīng)商可提供內(nèi)標(biāo)產(chǎn)品。絕大多數(shù)都是基于以下取代：2H(氘)取代氫原子，13C取代碳原子或是15N取代氮原子。13C和12C或是15N和15N之間的相對(duì)分子量差異遠(yuǎn)小于2H和1H之間的相對(duì)分子量差異，這使得13C和15N的使用更為普遍，因?yàn)橥凰匦?yīng)被盡可能地減少了。如果使用氘，則應(yīng)將實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量分辨率所需要的2H同位素標(biāo)記物的數(shù)量保持在最小值。

在選擇合適的內(nèi)標(biāo)時(shí)，需重點(diǎn)考慮以下四個(gè)因素。

1）內(nèi)標(biāo)合成過程中，由于前體的同位素標(biāo)記不完-全，會(huì)導(dǎo)致未標(biāo)記分子殘留而造成污染。理想情況下，未標(biāo)記分子比例應(yīng)< 2%，以避免復(fù)雜的修正計(jì)算。

2）分析物與其同位素之間的最-優(yōu)分子量偏差。選擇具備足夠分子量偏差的同位素內(nèi)標(biāo)，這樣可以避免跟分析物分子中天然存在的穩(wěn)定同位素造成的M+1, M+2, M+3等分析物譜線重疊(比如，30%天然比例的37Cl vs 35Cl，或是1%天然比例13C vs 12C)。對(duì)于分子量較小的有機(jī)分子(例如，50-800個(gè)質(zhì)量單位)的通用原則是：同位素內(nèi)標(biāo)與分析物之間應(yīng)該存在至少3個(gè)質(zhì)量單位的差別，對(duì)于存在多個(gè)氯原子的分子應(yīng)有更大的分子量偏差(這些分子在M+2和M+4處具備非常高的天然同位素比例)。但是，如果分析物和同位素內(nèi)標(biāo)之間總的相對(duì)分子量偏差太大，則“同位素效應(yīng)”(內(nèi)能不同所導(dǎo)致的)會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)層析分離。

3）很多情況下，根據(jù)所選條件的不同，對(duì)于具體的測(cè)試方法，標(biāo)記位點(diǎn)應(yīng)在碎片化之后的待測(cè)片段上（參見圖1和圖2）。

圖1：正確的氘標(biāo)記位置示例

圖2：錯(cuò)誤的氘標(biāo)記位置示例

4）提取方法應(yīng)具備很好的穩(wěn)定性。例如，避免2H標(biāo)記物位點(diǎn)緊鄰羰基基團(tuán)，因?yàn)轸驶鶊F(tuán)在某些條件下容易出現(xiàn)氫-氘置換。由于其在分子結(jié)構(gòu)中更加穩(wěn)定，13C 和15N的同位素標(biāo)記物應(yīng)用比2H更多。 18O同位素標(biāo)記物很少使用，這是因?yàn)檠踉釉诜肿觾?nèi)部通常處在不穩(wěn)定的位置上。

Section.02

如何規(guī)范使用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)

與所有常規(guī)的內(nèi)標(biāo)一樣，在檢測(cè)開始前（提取前）將穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)加入樣品中并使其在樣本中實(shí)現(xiàn)平衡。如果未做到這一點(diǎn)，則與分析物相比，內(nèi)標(biāo)提取效率出現(xiàn)差異的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加。

樣品中所加入的穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)的濃度必須跟分析物校正范圍近似。如果同位素內(nèi)標(biāo)與分析物之間的摩爾比例出現(xiàn)很大的偏差，則分析物中天然比例相對(duì)較小的穩(wěn)定同位素（或是穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)中殘留的非同位素分析物）會(huì)變得比較突出，從而使校正不再是線性的。

穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)與其類似的分析物是一一對(duì)應(yīng)的。因此，對(duì)于多分析物電噴霧LC-MS方法而言，每一種分析物的定量都需要一種對(duì)應(yīng)的穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)。例如，在混配的類固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中，采用睪酮-d3確定其他雄激素的比例時(shí)所存在的風(fēng)險(xiǎn)要高于完-全不采用內(nèi)標(biāo)。

Section.03

穩(wěn)定同位素化合物定制合成

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·穩(wěn)定同位素標(biāo)記，包括D、13C、15N、18O和多重標(biāo)記

·特定位置同位素單標(biāo)記或多標(biāo)記

·部分或隨機(jī)標(biāo)記

·選擇性氨基酸類型標(biāo)記

·立體排列同位素標(biāo)記

·代謝物的同位素標(biāo)記

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