百歐博偉生物：在含有大量乳酸菌（如酸奶、泡菜、奶酪、發(fā)酵肉制品、益生菌制劑等樣品）的環(huán)境中，選擇性地抑制乳酸菌的生長，同時允許或促進(jìn)其他目標(biāo)非乳酸菌（如酵母、霉菌、腸球菌、某些革蘭氏陰性桿菌等）的生長和分離。

一、原理

非乳酸菌選擇性培養(yǎng)基的原理主要基于以下幾個方面：

1、抑制乳酸菌生長：這是最關(guān)鍵的部分。利用乳酸菌對某些物質(zhì)高度敏感的特性，在培養(yǎng)基中添加特定的抑制劑。

抑制真核生物（酵母、霉菌）的蛋白質(zhì)合成，但對原核生物（細(xì)菌）作用微弱。然而，在非乳酸菌選擇性培養(yǎng)基中，它常被用來抑制污染的真菌（如果目標(biāo)是非乳酸細(xì)菌），或者作為選擇性成分之一（如果目標(biāo)是酵母/霉菌）。關(guān)鍵點在于，許多乳酸菌（尤其是乳桿菌）對也高度敏感，因此它能有效抑制乳酸菌。劑量是關(guān)鍵，過高可能連目標(biāo)酵母/霉菌也抑制了。

青霉素G、萬古霉素、莫匹羅星：主要抑制革蘭氏陽性菌（包括絕大多數(shù)乳酸菌）。萬古霉素對腸球菌效果較差（腸球菌天然耐藥），因此有時可用于從乳酸菌中分離腸球菌。

多粘菌素B/粘菌素：主要抑制革蘭氏陰性菌（非目標(biāo)），有時用于保護(hù)目標(biāo)革蘭氏陽性非乳酸菌（如某些芽孢桿菌）免受雜菌干擾。

抑制含有血紅素的呼吸酶（如細(xì)胞色素氧化酶）。對許多乳酸菌（特別是鏈球菌、腸球菌）有抑制作用，但對某些非乳酸菌（如一些酵母、腸球菌）抑制作用較弱或無效。常用于腸球菌選擇性培養(yǎng)基。

高pH：乳酸菌通常耐酸（pH 5.5-6.2），但在較高pH（如8.0-9.6）下生長受到強(qiáng)烈抑制。調(diào)整培養(yǎng)基pH到堿性范圍可以有效抑制絕大多數(shù)乳酸菌。

高鹽濃度：某些乳酸菌對高滲透壓敏感。加入高濃度鹽（如6.5% NaCl或更高）可以抑制部分乳酸菌，同時允許耐鹽的目標(biāo)菌（如腸球菌、某些酵母如德巴利酵母）生長。

特定碳源/營養(yǎng)限制：使用乳酸菌無法利用的碳源（如菊粉、甘露醇），或者不提供乳酸菌生長必需的特定生長因子（如某些氨基酸、維生素）。

2、促進(jìn)/允許目標(biāo)非乳酸菌生長：在抑制乳酸菌的同時，培養(yǎng)基應(yīng)提供目標(biāo)非乳酸菌生長所需的營養(yǎng)成分。

碳源/氮源：提供目標(biāo)菌能利用的底物（如葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母提取物）。

指示系統(tǒng) (可選)：某些培養(yǎng)基包含指示劑，便于識別目標(biāo)菌落。

pH指示劑：目標(biāo)菌發(fā)酵特定糖產(chǎn)酸時菌落周圍變黃（如腸球菌發(fā)酵蔗糖）。

氧化還原指示劑：被還原時在菌落內(nèi)形成紅色（如腸球菌選擇性培養(yǎng)基）。

顯色底物：特定酶作用后產(chǎn)生顏色（如某些顯色培養(yǎng)基）。

二、常見類型及舉例

1、酵母/霉菌選擇性培養(yǎng)基 (抑制乳酸菌和細(xì)菌)：

原理：高濃度抗生素抑制細(xì)菌（包括乳酸菌） + 抑制霉菌（如果目標(biāo)是酵母）/或者不加（如果目標(biāo)是霉菌）。常用基礎(chǔ)培養(yǎng)基是馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）或麥芽提取物瓊脂（MEA）。

改良：在PDA/MEA基礎(chǔ)上添加抗生素（氯霉素 50-100mg/L）和（50-500mg/L，具體濃度需優(yōu)化，既要抑制乳酸菌又要讓目標(biāo)酵母生長）。有時也添加乳酸（降低pH至3.5-5.0）進(jìn)一步抑制細(xì)菌。

例子：含有氯霉素和的DRBC瓊脂、YM（Yeast Mold）瓊脂。

2、腸球菌選擇性培養(yǎng)基 (抑制乳酸乳桿菌等，允許腸球菌生長)：

原理：抑制大多數(shù)乳酸菌（尤其鏈球菌）和部分革蘭氏陰性菌 + TTC作為指示劑（腸球菌還原TTC成紅色甲臜）?；A(chǔ)培養(yǎng)基含酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖等。

例子：Slanetz & Bartley培養(yǎng)基（KF鏈球菌瓊脂）、腸球菌顯色培養(yǎng)基。

3、假單胞菌等革蘭氏陰性桿菌選擇性培養(yǎng)基 (抑制乳酸菌和革蘭氏陽性菌)：

原理：高pH（如8.0-9.0）強(qiáng)烈抑制乳酸菌 + 特定碳源抑制其他革蘭氏陰性菌 + 抗生素（如多粘菌素B）抑制其他細(xì)菌。基礎(chǔ)培養(yǎng)基如假單胞菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

例子：CET (Cephaloridine-Fucidin-Cetrimide) 瓊脂（常用于乳制品中假單胞菌計數(shù)）。

4、通用型非乳酸菌選擇性基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (需添加抑制劑)：

原理：使用營養(yǎng)豐富的非選擇性基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如腦心浸液瓊脂BHI、胰蛋白酶大豆瓊脂TSA），額外添加針對乳酸菌的抑制劑。這種方法靈活性高，可根據(jù)具體目標(biāo)菌和樣品類型優(yōu)化抑制劑種類和濃度。

例子：TSA + (100mg/L) + 青霉素G (1-10 IU/mL) 常用于從發(fā)酵食品中分離酵母和非乳酸細(xì)菌。

三、使用方法

1、培養(yǎng)基準(zhǔn)備：

按照制造商說明或標(biāo)準(zhǔn)配方稱量干粉培養(yǎng)基和所需抑制劑（如抗生素溶液）。

加入蒸餾水溶解。

注意抑制劑的熱穩(wěn)定性：許多抗生素對熱敏感，高溫滅菌會失活。標(biāo)準(zhǔn)操作是：

基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分（不含抑制劑）常規(guī)高壓滅菌（121°C, 15分鐘）。

待滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至約45-50°C（不燙手但未凝固）。

將過濾除菌（0.22μm濾膜）的抗生素/抑制劑溶液（按最終所需濃度計算好體積）無菌操作加入溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基中。

輕輕搖勻（避免產(chǎn)生氣泡）。

立即傾注無菌平皿（約15-20mL/90mm平皿）。

待瓊脂凝固后，倒置平板。

制備好的平板可冷藏（2-8°C）保存，通常在有效期內(nèi)使用（1-4周，具體看配方和抑制劑穩(wěn)定性）。

2、樣品處理：

根據(jù)樣品類型（固體、液體）進(jìn)行均質(zhì)或稀釋。對于高乳酸菌含量的樣品（如酸奶），通常需要較大倍數(shù)的稀釋（如10^-3, 10^-4, 10^-5）才能獲得可計數(shù)的平板。

3、接種與涂布：

選擇2-3個合適的稀釋度。

取0.1mL或1mL稀釋液（具體體積根據(jù)預(yù)期菌量）無菌操作滴加到干燥的選擇性培養(yǎng)基平板上。

使用無菌涂布棒將樣品均勻涂布于整個瓊脂表面。

設(shè)置對照：建議設(shè)置空白對照（只涂稀釋液）和陽性對照（涂布已知目標(biāo)菌株）以驗證培養(yǎng)基的選擇性和促生長能力。

4、培養(yǎng)：

倒置平板放入恒溫培養(yǎng)箱。

溫度和時間：

目標(biāo)為酵母/霉菌：通常25-30°C，培養(yǎng)3-7天（霉菌可能需要更長時間）。

目標(biāo)為腸球菌：通常35-37°C，培養(yǎng)24-48小時。

目標(biāo)為假單胞菌等：通常25-30°C或30-35°C，培養(yǎng)24-72小時。

具體培養(yǎng)條件需根據(jù)目標(biāo)菌株和培養(yǎng)基說明書確定。

濕度：對于需要長時間培養(yǎng)（如酵母霉菌），保持培養(yǎng)箱內(nèi)一定濕度（如80%）可防止平板干燥。

5、結(jié)果判讀：

培養(yǎng)結(jié)束后，觀察平板上生長的菌落。

根據(jù)培養(yǎng)基特性（如指示劑顏色變化、菌落形態(tài)、大小、顏色、邊緣等）初步識別目標(biāo)菌落。

計數(shù)符合目標(biāo)菌落特征的菌落（CFU/g 或 CFU/mL）。

重要提示：選擇性培養(yǎng)基上的菌落不能僅憑形態(tài)就確認(rèn)為目標(biāo)菌。必須進(jìn)行純化和確證試驗！ 如：

挑取可疑菌落劃線到非選擇性培養(yǎng)基上純化。

進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。

進(jìn)行生化試驗（如糖發(fā)酵、氧化酶、過氧化氫酶、凝固酶等）。

使用特異性顯色培養(yǎng)基或分子生物學(xué)方法進(jìn)行確認(rèn)。

四、關(guān)鍵注意事項

抑制劑濃度至關(guān)重要：濃度過低無法有效抑制乳酸菌；濃度過高則可能抑制目標(biāo)非乳酸菌。需要根據(jù)樣品類型和目標(biāo)菌進(jìn)行優(yōu)化或遵循已驗證的配方。

樣品稀釋度：發(fā)酵樣品中乳酸菌數(shù)量通（10^8-10^9 CFU/g或更高），必須進(jìn)行足夠倍數(shù)的稀釋（如10^-4, 10^-5, 10^-6），否則目標(biāo)非乳酸菌會被掩蓋。

抑制劑選擇：不同抑制劑對不同乳酸菌屬/種的抑制效果不同。例如，對乳桿菌抑制效果好，但對腸球菌效果差；對鏈球菌抑制強(qiáng)，對腸球菌抑制弱。選擇抑制劑需考慮目標(biāo)非乳酸菌和樣品中優(yōu)勢乳酸菌的種類。

熱敏感抑制劑的無菌添加：這是操作成敗的關(guān)鍵步驟，必須嚴(yán)格無菌操作。

培養(yǎng)條件：溫度和時間對目標(biāo)菌的生長和形態(tài)影響很大，務(wù)必按推薦條件執(zhí)行。

確證試驗：選擇性培養(yǎng)基上的菌落必須經(jīng)過純化和確證試驗才能報告為目標(biāo)菌。假陽性和假陰性都可能存在。

培養(yǎng)基質(zhì)量控制：定期使用標(biāo)準(zhǔn)菌株驗證培養(yǎng)基的性能（抑制能力和促生長能力）。

總結(jié)：非乳酸菌選擇性培養(yǎng)基通過添加特異性抑制劑或調(diào)整理化條件（如高pH）來抑制乳酸菌，同時提供適宜目標(biāo)非乳酸菌（如酵母、霉菌、腸球菌、某些G-桿菌）生長的營養(yǎng)和環(huán)境。其成功應(yīng)用依賴于正確的培養(yǎng)基選擇與制備（尤其注意熱敏感抑制劑的無菌添加）、合適的樣品稀釋度、規(guī)范的接種涂布、準(zhǔn)確的培養(yǎng)條件設(shè)定以及對結(jié)果的謹(jǐn)慎判讀和確證試驗。

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