一、實驗前期準(zhǔn)備

1. 材料預(yù)處理：蛋白需經(jīng)透析或凝膠過濾，去除 Tris、甘氨酸等含氨基的緩沖液（避免競爭反應(yīng)），純度≥90%，濃度調(diào)整為 1-10 mg/mL。

2. 試劑準(zhǔn)備：ICG-NHS 酯（常用活性形式）用無水 DMSO 溶解，配制成 10-20 mg/mL 儲備液，現(xiàn)配現(xiàn)用；緩沖液選用 PBS（pH 7.0-8.5）或碳酸鹽緩沖液（pH 8.0-9.0），無氨基干擾。

3. 器材準(zhǔn)備：離心管、移液槍、透析袋（截留分子量＜蛋白分子量 1/3）或凝膠過濾柱（如 Sephadex G-25），全程避光（包裹鋁箔）。

二、標(biāo)記反應(yīng)操作

1. 按摩爾比 5:1 至 20:1（ICG: 蛋白）計算所需 ICG 儲備液體積，緩慢滴加到蛋白溶液中。

2. 室溫下避光輕柔振蕩孵育 15-60 分鐘，避免劇烈攪拌導(dǎo)致蛋白變性。

3. 若反應(yīng)體系出現(xiàn)沉淀，需立即終止并降低 ICG 濃度或調(diào)整 pH。

三、游離 ICG 去除（純化）

1. 透析法：將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入透析袋，在 PBS 緩沖液中 4℃避光透析 24-48 小時，期間更換 3-4 次緩沖液，去除游離 ICG。

2. 凝膠過濾層析法：用 Sephadex G-25 柱，以 PBS 為洗脫液，搜集吸收峰（蛋白 - ICG 復(fù)合物），丟棄后續(xù)游離 ICG 峰。

四、標(biāo)記產(chǎn)物質(zhì)控

1. 標(biāo)記效率驗證：通過紫外 - 可見分光光度法，分別測定 680-800 nm（ICG 特征吸收）和 280 nm（蛋白特征吸收）的吸光度，計算偶聯(lián)率（一般目標(biāo) 3-8 個 ICG 分子 / 蛋白）。

2. 蛋白活性驗證：采用 ELISA、細(xì)胞結(jié)合實驗或酶活性測定，確認(rèn)標(biāo)記后蛋白功能未受顯著影響。

3. 穩(wěn)定性驗證：4℃避光儲存 1-2 周，定期檢測吸光度，觀察是否出現(xiàn)聚集或降解。