大鼠肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)是開展肝膽相關(guān)研究的基礎(chǔ)技術(shù)，其核心是通過酶解、離心、篩選等步驟獲得高純度的目標(biāo)細(xì)胞，并提供適宜的培養(yǎng)環(huán)境維持其生物學(xué)特性。以下是常用的分離培養(yǎng)方法及關(guān)鍵步驟：

一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1、實(shí)驗(yàn)動物：選擇健康的成年大鼠，體重 200-300g，雌雄均可，實(shí)驗(yàn)前禁食 12 小時(shí)，避免肝臟脂肪堆積影響細(xì)胞分離。

2、試劑與耗材

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：常用 DMEM/F12 培養(yǎng)基，添加 10%-15% 胎牛血清、100U/mL 、100μg/mL ，以及上皮細(xì)胞生長添加劑。

酶解液：配置含 0.1%-0.2% 膠原酶 Ⅳ、0.05%-0.1% 透明質(zhì)酸酶的無血清 DMEM/F12 溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用，37℃預(yù)熱。

其他試劑：PBS 緩沖液、0.25% 白酶 - EDTA 溶液、細(xì)胞角蛋白 19抗體（用于后續(xù)鑒定）、鼠尾膠原 Ⅰ（用于包被培養(yǎng)瓶）。

耗材：無菌手術(shù)器械（剪刀、鑷子、止血鉗）、離心管、培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿、濾網(wǎng)、移液管等，均經(jīng)高壓滅菌處理。

3、實(shí)驗(yàn)環(huán)境：所有操作在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，維持無菌環(huán)境；培養(yǎng)箱提前調(diào)試至 37℃、5% CO?、飽和濕度條件。

二、細(xì)胞分離步驟

1、肝臟取材與灌注

大鼠經(jīng)腹腔注射，固定于手術(shù)臺，腹部消毒并剪開腹腔，暴露肝臟及門靜脈。

用注射器穿刺門靜脈，緩慢注入 37℃預(yù)熱的 PBS 緩沖液，同時(shí)剪開肝靜脈放血，持續(xù)灌注至肝臟顏色由紅變?yōu)榈S色，去除肝臟內(nèi)殘留血液。

2、肝臟組織消化

剝離肝臟并置于無菌培養(yǎng)皿中，用眼科剪將肝臟剪成 1-2mm3 的細(xì)小組織塊，加入預(yù)熱的酶解液，轉(zhuǎn)移至搖瓶中。

37℃、50r/min 恒溫?fù)u床孵育 30-60 分鐘，期間每隔 10 分鐘輕輕吹打組織塊，促進(jìn)酶解充分。

酶解結(jié)束后，加入含血清的培養(yǎng)基終止酶反應(yīng)，用 100 目濾網(wǎng)過濾，去除未消化的組織碎片，收集過濾后的細(xì)胞懸液。

3、細(xì)胞純化

將細(xì)胞懸液移入離心管，1000r/min 離心 5 分鐘，棄上清，用 PBS 重懸細(xì)胞并再次離心洗滌 2 次，去除殘留酶液和雜質(zhì)。

可采用密度梯度離心進(jìn)一步純化：將細(xì)胞重懸液緩慢鋪于 40%-70% 密度梯度液上層，1500r/min 離心 20 分鐘，收集中間層的膽管上皮細(xì)胞（肝細(xì)胞等雜質(zhì)位于上層或下層）。

用培養(yǎng)基重懸純化后的細(xì)胞，200 目濾網(wǎng)再次過濾，獲得單細(xì)胞懸液。

三、細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

1、原代培養(yǎng)

提前用鼠尾膠原 Ⅰ 包被培養(yǎng)瓶（10μg/cm2），37℃孵育 2 小時(shí)后吸棄包被液，晾干備用（增強(qiáng)細(xì)胞貼壁能力）。

將單細(xì)胞懸液接種至包被后的培養(yǎng)瓶中，調(diào)整細(xì)胞密度為 1×10?-5×10?個(gè) /mL，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

培養(yǎng) 24 小時(shí)后換液，去除未貼壁的死細(xì)胞；之后每 2-3 天換液一次，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

2、傳代培養(yǎng)

當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到 80%-90% 時(shí)進(jìn)行傳代。吸棄舊培養(yǎng)基，用 PBS 洗滌細(xì)胞 2 次，去除殘留血清。

加入適量 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 溶液，37℃孵育 2-3 分鐘，顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓、間隙增大時(shí)，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。

用移液管輕輕吹打培養(yǎng)瓶壁，使細(xì)胞脫落并分散成單細(xì)胞懸液，1000r/min 離心 5 分鐘，棄上清。

用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按 1:2 或 1:3 的比例接種至新的包被培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。大鼠肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)后通?？蓚?1-2 代，傳代次數(shù)過多會導(dǎo)致細(xì)胞功能衰退。

四、細(xì)胞鑒定與質(zhì)量控制

純度鑒定：采用免疫熒光染色法，以 CK-19 抗體為特異性標(biāo)志物（膽管上皮細(xì)胞高表達(dá) CK-19，肝細(xì)胞不表達(dá)），熒光顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞比例，純度需達(dá)到 90% 以上。

活性鑒定：臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活性，活細(xì)胞拒染臺盼藍(lán)，活性應(yīng)高于 85%。

污染檢測：定期觀察細(xì)胞形態(tài)，若出現(xiàn)培養(yǎng)基渾濁、有異常顆粒或菌絲，需進(jìn)行細(xì)菌、真菌檢測；通過 PCR 法檢測支原體污染，確保細(xì)胞無外源污染。

五、注意事項(xiàng)

酶解過程是關(guān)鍵，酶濃度過高或孵育時(shí)間過長會損傷細(xì)胞，過低則消化不充分，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況優(yōu)化參數(shù)。

全程嚴(yán)格無菌操作，避免污染；所有溶液需提前預(yù)熱至 37℃，減少溫度變化對細(xì)胞的損傷。

原代細(xì)胞對培養(yǎng)環(huán)境敏感，血清和生長添加劑的質(zhì)量直接影響細(xì)胞生長，需選擇合格試劑并嚴(yán)格控制濃度。

傳代時(shí)避免過度吹打，防止細(xì)胞機(jī)械損傷，影響后續(xù)生長活性。

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