Q1：Label-Free Quantification (LFQ)的技術(shù)特點(diǎn)是什么？

A1：

1、無需化學(xué)或同位素標(biāo)記

直接基于質(zhì)譜信號(hào)進(jìn)行定量，避免了標(biāo)簽引入的額外步驟與成本。

2、準(zhǔn)確度略低于標(biāo)記定量

由于缺乏內(nèi)源性或外源性標(biāo)簽的校正，LFQ 的定量精確性通常略低于 SILAC、TMT 等標(biāo)記方法。

3、樣本通量高、靈活性強(qiáng)

不受標(biāo)簽通道數(shù)量限制，可同時(shí)分析更多樣本，適合大規(guī)模研究。

4、對實(shí)驗(yàn)一致性要求高

定量結(jié)果易受樣品前處理、液相色譜穩(wěn)定性和儀器狀態(tài)影響，需要嚴(yán)格的質(zhì)量控制與歸一化處理。

5、至少需要 3 個(gè)技術(shù)和生物學(xué)重復(fù)

以提高數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)可靠性，降低實(shí)驗(yàn)波動(dòng)對定量結(jié)果的影響。

Q2：LFQ 主要有哪些常用定量策略？

A2：Label-Free Quantification（LFQ）主要有以下兩種常用定量策略：

1、峰面積積分（Area Under the Curve, AUC）

通過提取 MS1 層面的色譜峰并計(jì)算曲線下面積，反映肽段在不同樣品中的相對豐度，精度較高，適合檢測信號(hào)穩(wěn)定且峰形良好的數(shù)據(jù)。

2、譜圖計(jì)數(shù)（Spectral Counting）

統(tǒng)計(jì)目標(biāo)蛋白質(zhì)在 MS/MS 中被采集和鑒定的譜圖次數(shù)，用于估算相對豐度，方法簡單，但對低豐度蛋白的敏感性較差。

Q3：在 LFQ 中，DDA 和 DIA 哪種采集模式更優(yōu)？

A3：在 LFQ（Label-Free Quantification）中，DIA（Data-Independent Acquisition）通常更優(yōu)，原因如下：

· DDA（Data-Dependent Acquisition）

依據(jù)信號(hào)強(qiáng)度選擇前體離子進(jìn)行碎裂，適合探索性鑒定，但低豐度肽段易漏檢，跨樣本數(shù)據(jù)缺失率較高。

· DIA（Data-Independent Acquisition）

采用全譜采集方式，覆蓋所有前體離子，數(shù)據(jù)重復(fù)性和一致性好，缺失值率低，尤其適合大規(guī)模、多批次 LFQ 項(xiàng)目。

總結(jié)：若目標(biāo)是提高定量一致性、減少缺失值并適應(yīng)大規(guī)模比較分析，推薦 DIA；若是以新蛋白發(fā)現(xiàn)為主的探索性研究，DDA 仍有應(yīng)用價(jià)值。

Q4：為什么無標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)，可以比較不同類型的樣品？

A4：無標(biāo)記定量基于質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度或譜圖計(jì)數(shù)進(jìn)行相對定量，不依賴統(tǒng)一的化學(xué)或同位素標(biāo)簽。只要不同類型的樣品在前處理、色譜條件、質(zhì)譜采集和數(shù)據(jù)分析流程上保持一致，并通過保留時(shí)間對齊等算法識(shí)別相同肽段，就能實(shí)現(xiàn)跨樣品類型的蛋白豐度比較。

Q5：如何解決 LFQ 中的缺失值問題？

A5：無標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)本質(zhì)上依賴質(zhì)譜信號(hào)的強(qiáng)度對蛋白質(zhì)進(jìn)行相對定量，因此，任何一個(gè)步驟的波動(dòng)，如樣本前處理、液相分離穩(wěn)定性、質(zhì)譜儀性能狀態(tài)等，都會(huì)導(dǎo)致信號(hào)丟失或檢測不到，表現(xiàn)為數(shù)據(jù)矩陣中的大量缺失值（Missing Values）。

為減少缺失值影響，可采取以下措施：

1、優(yōu)化樣品前處理，降低蛋白降解與肽段損失。

2、保持色譜與質(zhì)譜系統(tǒng)穩(wěn)定，減少峰漂移與信號(hào)波動(dòng)。

3、增加技術(shù)和生物學(xué)重復(fù)，提高檢測覆蓋率與統(tǒng)計(jì)可靠性。

4、采用 DIA 等全譜采集模式，降低低豐度肽段漏檢率。

5、在數(shù)據(jù)分析中合理填補(bǔ)缺失值（如低豐度假設(shè)插補(bǔ)），并結(jié)合歸一化提高比較精度。

Q6：進(jìn)行 LFQ 時(shí)，如何處理共享肽段（shared peptides）？

A6：共享肽段是指來源于多個(gè)蛋白質(zhì)、序列wán quán相同的肽段。處理方式主要有兩種：

1、排除法：在定量計(jì)算中僅使用 wéi yī 肽段（unique peptides），避免共享肽段引入的歸屬不確定性。

2、分配法：基于概率模型或肽段在各蛋白的 wéi yī 肽段信號(hào)比例，將共享肽段信號(hào)按比例分配到對應(yīng)蛋白，從而保留更多定量信息。

選擇方法取決于研究目的：探索性研究可優(yōu)先保留信息（分配法），而高精度定量通常傾向于排除法。

Q7：在 LFQ 中，如何判斷定量結(jié)果的顯著性？

A7：需結(jié)合統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)（如 t 檢驗(yàn)、ANOVA）與多重假設(shè)檢驗(yàn)校正（FDR 控制），并建議結(jié)合生物學(xué)重復(fù)計(jì)算變異系數(shù)（CV）來評估定量的穩(wěn)健性。

Q8：非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)和標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)的適用場景有何差別？

A8：

1、非標(biāo)記定量（LFQ，尤其是 DIA 模式）

更適合樣本組數(shù)較多（通常超過 10 組）、來源差異較大（不同物種、組織或部位）的平行蛋白組定量研究。適用于需要判斷蛋白是否存在、追求高精度定性與定量、并希望避免標(biāo)簽或分組帶來的系統(tǒng)誤差的項(xiàng)目。同時(shí)，采集的數(shù)據(jù)可多次進(jìn)行深度挖掘與再分析。

2、標(biāo)記定量（如 TMT、iTRAQ、SILAC）

更適合同時(shí)比較的樣本數(shù)較少（通常 ≤10 組），且樣本背景一致性較高（同一物種、相同類型樣本）的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。在這些情況下，標(biāo)記定量能在單次質(zhì)譜運(yùn)行中實(shí)現(xiàn)多樣本的高精度比較，降低批次效應(yīng)。

Q9：如何在 LFQ 中判斷“有無"表達(dá)差異？

A9：對同一樣本的多次質(zhì)譜檢測結(jié)果通常不會(huì)wán quán一致，重疊率大概為70%。為了后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析的合理性，一般僅保留在三次技術(shù)重復(fù)中至少兩次被鑒定（即具有非零定量值）的蛋白質(zhì)，并以平均值進(jìn)行定量。如果某蛋白在一組樣本的三次重復(fù)中均無定量值（或定量值為零），而在另一組中至少兩次出現(xiàn)非零定量值，則可初步判斷存在“有無"差異。不過，這類差異的結(jié)論需謹(jǐn)慎對待，建議結(jié)合其他驗(yàn)證手段（如 PRM、Western blot）進(jìn)行確認(rèn)。

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