端粒和端粒酶檢測是當(dāng)前發(fā)展的熱點

端粒和端粒酶是當(dāng)今生物界熱門的研究領(lǐng)域之一。端粒酶活性已經(jīng)成為各國科學(xué)家們爭相研究的熱點。

端粒(Telomere)是一種位于真核生物染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，端粒DNA由一系列串聯(lián)TTAGGG重復(fù)序列構(gòu)成,長度約3~20kb不等。端粒結(jié)構(gòu)能維持染色體末端穩(wěn)定，避免DNA發(fā)生降解、修飾、基因錯誤重組和丟失。

端粒酶是一種復(fù)合物，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性和功能。人類細(xì)胞中端粒酶主要由RNA模板(TER)，逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和輔助蛋白(TERP1)等三個組分構(gòu)成，分子量約為500~1500KDa。其中hTERT能夠利用自身的RNA模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒片段,在端粒酶活性及端粒長度維持中起到?jīng)Q定性作用。

端粒酶活性其本質(zhì)是端粒酶在細(xì)胞內(nèi)催化端粒延長的生物學(xué)能力，而這種能力直接關(guān)聯(lián)染色體穩(wěn)定性、細(xì)胞衰老與疾病發(fā)生。深入理解端粒酶活性的調(diào)控機(jī)制與功能，對研究衰老、癌癥治療等領(lǐng)域具有重要意義。

在正常細(xì)胞分裂過程中，DNA 聚合酶無法完整復(fù)制染色體末端，導(dǎo)致端粒隨分裂次數(shù)增加而逐漸縮短，也是細(xì)胞衰老的重要標(biāo)志，所以端粒也稱為生命的時鐘。

當(dāng)端粒酶活性被激活時，其攜帶的 RNA 模板可逆轉(zhuǎn)錄合成端粒 DNA，補(bǔ)充磨損的端粒長度，維持染色體完整性，防止基因組不穩(wěn)定。同時抵消分裂帶來的端粒損耗，延長細(xì)胞壽命。干細(xì)胞和生殖細(xì)胞通過持續(xù)的端粒酶活性維持自我更新能力。

而對于大多數(shù)成體細(xì)胞（如皮膚細(xì)胞、肝細(xì)胞等），端粒酶活性被嚴(yán)格抑制，端粒隨分裂逐漸縮短，最終引發(fā)細(xì)胞衰老或凋亡，這一機(jī)制可防止細(xì)胞過度增殖，防止癌變的發(fā)生。

二、端粒酶活性的調(diào)控機(jī)制

端粒酶活性受細(xì)胞內(nèi)多重信號通路、轉(zhuǎn)錄因子及表觀遺傳修飾的調(diào)控，包括：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控和表觀遺傳學(xué)調(diào)控等多種調(diào)控方式。

轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控：多種轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合 hTERT 啟動子，促進(jìn)其表達(dá)；而一些抑癌因子則抑制 hTERT 轉(zhuǎn)錄，下調(diào)端粒酶活性。

表觀遺傳調(diào)控：hTERT 啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)直接影響其轉(zhuǎn)錄活性。如hTERT 啟動子高度甲基化，導(dǎo)致基因沉默；啟動子甲基化水平降低，則端粒酶活性增強(qiáng)。

三、端粒酶檢測方法

端粒酶活性作為一項重要的生物活性指標(biāo)，如何準(zhǔn)確?靈敏?快速地獲得端粒酶活性成為了在臨床診斷和治療方面的一大熱點?

端粒重復(fù)擴(kuò)增法（TRAP）是傳統(tǒng)的檢測方法，通過 PCR 擴(kuò)增端粒重復(fù)序列，以后的很多關(guān)于端粒酶活性的研究方法均基于PCR技術(shù)提出該方法靈敏度高，但操作較略復(fù)雜。擴(kuò)增后通過電泳或熒光檢測定量檢測。

免疫學(xué)方法：通過特異性抗體檢測 hTERT 蛋白的表達(dá)。

實時定量檢測方法：結(jié)合實時熒光 PCR 技術(shù)，可快速定量端粒酶活性，適用于大量樣本的高通量檢測，已廣泛應(yīng)用于癌癥臨床樣本分析。

翼和生物開發(fā)的端粒酶檢測試劑盒能通過熒光定量PCR的很好的完成端粒酶活性檢測。原理是：TERT被認(rèn)為是端粒酶活性表達(dá)的關(guān)鍵組分，其編碼的mRNA水平與端粒酶活性一致。 因此，對端粒酶催化亞基的檢測可以間接反映樣本中端粒酶活性。具體是采用雙色熒光qPCR (TaqMan探針法) 檢測端粒酶催化亞基TERT基因和內(nèi)參基因GAPDH。通過提取細(xì)胞RNA，利用特異性逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以cDNA為模板在單管中利用多重?zé)晒舛縋CR進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng) (雙重探針：FAM、Cy5)。選用293T細(xì)胞為陽性對照以及MRC-5細(xì)胞為陰性對照，判斷樣本中是否有TERT基因表達(dá)。端粒酶活性檢測試劑盒具有靈敏性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、結(jié)果可靠、操作方便等優(yōu)點，并且可以通過CT值進(jìn)行定量。